Nukleinsäurediagnostik spannt ein weites Feld von der Pathogendiagnostik (z. B. der Detektion von Nukleinsäuren aus Viren) bis hin zur Analyse von Varianzen einzelner Nukleotide im gesamten Genom, wie sie z. B. als Punktmutationen oder Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (sog. Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) vorkommen. Für die meisten analytischen Methoden sind technisch anspruchsvolle Geräte notwendig. Ziel dieses Projekts ist es, Methoden zu entwickeln, die die Detektion von Nukleinsäuren mit einer Auflösung von einzelnen Nukleotiden mit dem „bloßen Auge“ (naked eye detection) erlauben, ohne dass Amplifikationsschritte wie die PCR nötig sind. Solche Systeme wären für eine patientennahe Labordiagnostik (point of care testing) oder Anwendungen, z.B. in der Pathogendiagnose, „im Feld“ von großem Nutzen. Als Grundlage für solche Systeme sind DNA-Polymerasen vielversprechend, da sie hoch sequenz-spezifisch den Einbau eines Nukleotids in Abhängigkeit des Templats katalysieren. Methoden, die den einzelnen Nukleotideinbau mit einem mit dem bloßen Auge detektierbaren Signal koppeln, sind jedoch noch nicht beschrieben. Die Entwicklung solcher Methoden, die auf dem Einbau eines modifizierten Nukleotids beruhen, steht im Fokus dieses Vorhabens. Kürzlich konnten wir zeigen, dass bestimmte DNA-Polymerasen in der Lage sind, sequenz-spezifisch Oligodesoxynukleotid(ODN)-markierte Nukleosidtriphosphate in einen wachsenden DNA-Strang einzubauen. Bemerkenswert ist der Befund, dass selbst ODN-Modifikation von DNA-Polymerasen toleriert wurde, die wesentlich größer (z. B. 40 Nukleotide lang) sind als das Nukleosidtriphosphat selbst. In diesem Vorhaben werden wir den sequenz-spezifischen Einbau solch ODN-modifizierter Nukleotide ausnutzen. Die eingebaute ODN-Modifikation wird dabei als sequenz-spezifischer Marker verwendet, deren Erkennung mittels geeigneter Systeme zu einer Signalverstärkung führen wird, die den Einbau mit bloßem Auge detektierbar macht. Dieses System wird es ermöglichen, Nukleinsäuren mit „Einzel-Nukleotid-Auflösung“, wie es z. B. in der Mutations- oder SNP-Analyse notwendig ist, ohne teure Gerätschaften mit bloßem Auge zu detektieren. Darüber hinaus werden wir den Einbau der modifizierten Nukleotide in funktionellen und strukturellen Studien untersuchen. Dies wird zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen, mit denen diese sehr großen Nukleotidanaloga prozessiert werden. Da Nukleotidanaloga generell auch für zahlreiche biotechnische Anwendungen eingesetzt werden, ist auch ein Erkenntnisgewinn für dieses Feld zu erwarten. Zusätzlich werden durch strukturelle Untersuchungen von relevanten DNA-Polymerasen, die bisher noch nicht mit ihren gebundenen Substraten kristallisiert wurden, Einblicke in die Funktionsweisen dieser Enzyme gewonnen.
