Wir wollen Struktur und Funktion von Bindeprotein-abhängigen ABC-Transportern aus Prokaryonten untersuchen. Nach der Expression des Trehalose/Maltose-Transporterkomplexes (zusammen mit seinem Bindeprotein) aus dem hyperthermophilen Archaeon Thermococcus thermophilus in einem thermophilen Organismus, Thermus thermophilus, werden wir den Komplex reinigen und kristallisieren. Unser Ziel ist die vollständige strukturelle Darstellung eines intakten Bindeprotein-abhängien Transporters samt seiner Substraterkennungsstelle. Mit Hilfe heterologer Expression des Transporters in thermophilen Bakterien werden wir Mutanten, die durch gerichtete Mutagenese erzeugt wurden, funktionell analysieren. Diese mutierten Komplexe werden Einblicke in den Wirkungsmechanismus von ABC Transportern ermöglichen. So wollen wir beispielsweise Mutanten in der Nucleotidbindungssstelle des Transporters isolieren, die ATP zwar noch binden, aber nicht mehr hydrolisieren können. In Zusammenarbeit mit B. Stieger und P. Maier-Abt werden wir den ABC-Transporter für Glykolphosphat aus E. coli, Ugp, in Oozyten exprimieren und funktionelle Veränderungen untersuchen, die sowohl von der zytoplasmatischen Umgebung als auch vom Bindeprotein abhängen. Diese Untersuchungen werden dazu beitragen, die Mechanismen aufzuklären, mit denen die Transportaktivität durch zelluläre Metaboliten oder Stoffwechselprozesse reguliert wird.We intend to investigate the structure and function of binding protein-dependent ABC transporters from prokaryotes. Expression of the trehalose/maltose transporter complex (in combination with its binding protein) from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus thermophilus in a thermophilic organism, Thermus thermophilus, will be followed by its purification and crystallography. Our goal is the complete structural representation of an intact binding protein-dependent transporter including its substrate recognition site. Heterologous expression of the transporter in thermophilic bacteria will be used for functional analysis of mutants created by directed mutagenesis. These mutant complexes will permit insights into the mode of action of ABC transporters. For example, we aim at isolating mutants in the nucleotide binding site of the transporter which are still able to bind ATP but can no longer hydrolyse it. In cooperation with B. Stieger and P. Maier-Abt we will express the ABC transporter for glycol phosphate from E. coli, Ugp, in oocytes and study functional changes depending on the cytoplasmic environment as well as on the binding protein. These investigations will help to elucidate the mechanisms of how transport activity is regulated by cellular metabolites or metabolic processes.
